WB-考馬斯亮藍染色法

一、考馬斯亮藍結構

考馬斯亮藍R-250和G-250染料是二磺酸化三苯基甲烷化合物的兩種化學形式，結構上R-250比G-250少了2個甲基。

二、蛋白質染料要求

用染料和生物大分子結合形成有色的復合物是電泳后檢測常用的方法。選用染料通常應考慮以下要求：
1. 必須與大分子結合以形成一個不溶性的，有色的，緊密的復合物，但不結合到凝膠中和支持膜上，以便從凝膠中除去，否則高背景會影響蛋白帶的辨別和定量掃描。
2. 染料必須容易溶解在對大分子沒有影響的溶劑中，以利于背景的脫色。
3. 選用高吸光系數(shù)的染料有利于提高定量測定的靈敏度。
4. 選用能與大分子有專一性結合的染料，并在結合后能產生不同的顏色（如熒光)，可以提高檢測的選擇性和靈敏度。

三、考馬斯亮藍染色的應用

考馬斯亮藍又稱為Bradford法，是一種常用的蛋白定性定量分析方法。其主要利用Coomassie Brilliant Blue G-250這種酸性染料與蛋白質在酸性環(huán)境下產生吸附,導致染料的最大吸光波長從465 nm變?yōu)?/font>595 nm。通過制備不同濃度的牛血清白蛋白標準品液,與Bradford試劑混合后測定其595 nm吸光度值,繪制標準曲線。與標準品同量的樣品蛋白溶液與Bradford試劑混合。5 min后在595 nm波長下測定各樣品與標準品的吸光度。根據標準曲線,計算出各樣品的蛋白濃度。

此外，考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）與麗春紅染色一樣，也是WB實驗中常用的染色方法。

四、考馬斯亮藍染色的步驟

（1）電泳結束后，將膠板取出放入加有超純水的平皿中潤洗，以去除殘留電泳液。

（2）之后加入考馬斯亮藍染液浸沒，放至水平搖床室溫30 min或更長時間進行染色（具體根據凝膠厚度和溫度進行調整），直至凝膠與染色液顏色十分接近。

（3）棄去染色液或回收染色液（可回收使用3次左右）。

（4）脫色直至背景清晰。

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