免疫細(xì)胞（ICC）實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題有哪些？

免疫細(xì)胞化學(xué) (ICC) 是一種使用熒光抗體或染料來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)靶抗原的技術(shù)。那么免疫細(xì)胞（ICC）實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題有哪些？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、熒光信號(hào)弱

1. 樣品質(zhì)量

選用新鮮制備的樣本以及適當(dāng)?shù)谋３謼l件。

2. 靶標(biāo)豐度低

適當(dāng)提高一抗?jié)舛取?/span>

選擇熒光強(qiáng)度更強(qiáng)的二抗。

3. 固定方法不當(dāng)

甲醛和蛋白的氨基通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，可能會(huì)遮蓋抗原表位，導(dǎo)致靶表位信號(hào)減弱。建議調(diào)整抗原修復(fù)方法或固定方法。

多聚甲醛會(huì)與GFP熒光蛋白發(fā)生醛化反應(yīng)，導(dǎo)致信號(hào)減弱。

檢測(cè)膜蛋白一般不建議使用甲醇或丙酮固定，有機(jī)溶劑能夠破壞膜結(jié)構(gòu)。

4. 透化方法不當(dāng)

檢查靶標(biāo)蛋白表達(dá)位置，胞內(nèi)蛋白需要透化處理。

膜蛋白需要考慮所檢測(cè)靶表位位于膜內(nèi)還是膜外，膜外則不需要透化。

5. 信號(hào)放大不夠

如果檢測(cè)靶點(diǎn)是低豐度蛋白．信號(hào)弱可能是由于信號(hào)放大不足導(dǎo)致的，可以使用Invitrogen SuperBoost 酪胺信號(hào)放大技術(shù)，進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)低豐度，難以檢測(cè)蛋白的檢測(cè)。

二、背景太高

1. 封閉不足

（1）選用二抗種屬來(lái)源的血清封閉。

（2）選用鏈霉親和素/生物素系統(tǒng)，需要用鏈霉親和素封閉內(nèi)源的生物鏈酶。

（3）選用HRP系統(tǒng)，需要使用過(guò)氧化氫等商業(yè)化試劑盒去活化內(nèi)源性HRP。

（4）選用AP系統(tǒng)，需要使用左旋咪唑等商業(yè)化試劑去活化內(nèi)源性磷酸酶。

2. 一抗

一抗?jié)舛冗^(guò)高，減少用量

3. 二抗

（1）設(shè)置無(wú)一抗對(duì)照，幫助確認(rèn)背景是否來(lái)源二抗。

（2）二抗?jié)舛冗^(guò)高，減少用量。

（3）抗體凝聚，使用二抗前離心去掉抗體凝聚物。

（4）使用高交叉吸附的Alexa Fluor Plus二抗，信噪比比Alexa Fluor提高4-5倍。

4. 自發(fā)熒光

（1）設(shè)置自發(fā)熒光對(duì)照，確定是否自發(fā)熒光。

（2）固定劑如醛類和氨基共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致的自發(fā)熒光，可用硼氫化na去除。

（3）增加固定劑的漂洗次數(shù)。

（4）避開(kāi)背景高的波段，選用背景較低的波段檢測(cè)。

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