細(xì)胞轉(zhuǎn)染：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率影響因素

真核蛋白表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式有兩種：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，本文的主要介紹了兩者的定義和適用性及細(xì)胞轉(zhuǎn)染一般步驟，影響轉(zhuǎn)染效率的因素，幫助我們提高實(shí)驗(yàn)的成功率。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞有兩種方法：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的過(guò)程。質(zhì)粒、DNA、RNA將這些外源基因?qū)氲秸婧思?xì)胞內(nèi)并不容易，要跨越細(xì)胞膜的屏障進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是指外源基因?qū)氲郊?xì)胞后得以表達(dá)，但是基因不整合到細(xì)胞的基因組上，因此不會(huì)隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)復(fù)制。因此，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的時(shí)間有限，通常只持續(xù)幾天，直到外源基因在細(xì)胞生長(zhǎng)分裂過(guò)程中因各種因素消失為止。判斷細(xì)胞是否轉(zhuǎn)染成功，在構(gòu)建質(zhì)粒上含有報(bào)告基團(tuán)，以指示目標(biāo)基因是否存在，一般在轉(zhuǎn)染兩天后即能被檢測(cè)到。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)有一小部分的基因會(huì)整合到細(xì)胞基因組上，并隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂，質(zhì)粒會(huì)隨機(jī)分配到子細(xì)胞中從而稀釋直終丟失，所以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染要進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選，經(jīng)過(guò)篩選出來(lái)的細(xì)胞株，此時(shí)的質(zhì)粒已經(jīng)*整合到細(xì)胞基因組中，隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)復(fù)制并穩(wěn)定的遺傳給后代。

瞬轉(zhuǎn)穩(wěn)轉(zhuǎn)適用性

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)顯著的區(qū)別就是在時(shí)間上。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染后四天即能收獲細(xì)胞，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染一般用于基因產(chǎn)物的短期表達(dá)、基因敲除、蛋白質(zhì)的小規(guī)模合成。相對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)適用于長(zhǎng)期的藥理學(xué)研究遺傳調(diào)控機(jī)制研究及大規(guī)模的蛋白質(zhì)合成，需要大量的周期，因此更費(fèi)力成本投入高。目前，在進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白表達(dá)蛋白時(shí)，因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步和人們對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的不斷探索，人們已經(jīng)可以對(duì)一些常用細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)重組蛋白的大規(guī)模合成，節(jié)省了時(shí)間和成本。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染一般步驟

以24孔板進(jìn)行細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)為例，全程操作均為無(wú)菌狀態(tài)，以免造成細(xì)胞污染

1）轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備，細(xì)胞株或者直接培養(yǎng)后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，鋪板，培養(yǎng)基為含有1ml血清，不含抗性的正常培養(yǎng)基。

2）針對(duì)每孔細(xì)胞，用50-100ul無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋0.8-1.6ug的質(zhì)粒，并混勻

3）針對(duì)每孔細(xì)胞，用50-100ul無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋4ul左右的轉(zhuǎn)染試劑，混勻室溫防止5min

4）將第二第三步的溶液混勻室溫防止20-30min

5）用PBS沖洗細(xì)胞，在用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，在加入0.5ml的無(wú)血清培養(yǎng)基

6）將四步驟得到的混合物加入到每孔中，輕搖混勻后放入37℃，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6h

7）將無(wú)血清培養(yǎng)基換為血清培養(yǎng)基（10%胎牛血清）孵育24-96h后檢測(cè)結(jié)果。穩(wěn)定表達(dá)，在轉(zhuǎn)染24h后傳代新鮮培養(yǎng)液中，48h后加入抗性，穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)周時(shí)間。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染流程圖

影響轉(zhuǎn)染效率因素

1. 轉(zhuǎn)染試劑

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以選擇不同的轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染試劑的選擇又可以根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)。已經(jīng)有很多細(xì)胞株被成功轉(zhuǎn)染，通過(guò)文獻(xiàn)資料可以參考適的轉(zhuǎn)染試劑，當(dāng)然也要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求選擇。此外，不同的轉(zhuǎn)染方法也要選擇不同的試劑，一般要求是轉(zhuǎn)染試劑要低毒，高效，廉價(jià)易得。

2. 轉(zhuǎn)染方法

轉(zhuǎn)染方法分為兩類(lèi)：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，。根據(jù)細(xì)胞的性質(zhì)及不同的操作手法，摸索轉(zhuǎn)染條件。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染都需要優(yōu)化DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例， 細(xì)胞培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如磷酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法都各有利弊，關(guān)于各種轉(zhuǎn)染方法的比較和原理，可參見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)方法的比較。

3. 細(xì)胞狀態(tài)

一般傳代數(shù)小于50代以下的細(xì)胞即能保證基因型不變。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞是達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，容易被轉(zhuǎn)染。同一種系的細(xì)胞株，在不同實(shí)驗(yàn)室不同培養(yǎng)條件下，其生物學(xué)性狀都會(huì)產(chǎn)生不同改變，從而導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。因此，針對(duì)這種轉(zhuǎn)染效率降低的情況，應(yīng)轉(zhuǎn)用新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染達(dá)到好的結(jié)果。

4. 載體構(gòu)建

基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞不能有毒害作用，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染難以進(jìn)行。轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建選擇可調(diào)控，強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子很重要，可以做空載體或相同載體的其他基因?yàn)閷?duì)照排除毒性對(duì)細(xì)胞的影響。 病毒載體對(duì)特定宿主細(xì)胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細(xì)胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞。

5. 其他要求

（1）細(xì)胞培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的基本要素。不同細(xì)胞選擇不同的培養(yǎng)基，血清和其他添加物。使用的轉(zhuǎn)染試劑要參考其說(shuō)明書(shū)。培養(yǎng)物一定要避免細(xì)菌，支原體真菌的污染。

（2）血清

血清是一種包含生長(zhǎng)因子及其它輔助因子的成分不明確添加物，對(duì)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響細(xì)胞生長(zhǎng)，因此也會(huì)影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，不同批次購(gòu)買(mǎi)的血清質(zhì)量也會(huì)存在差別。對(duì)于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法要求在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，血清被認(rèn)為會(huì)降低瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的效率。針對(duì)現(xiàn)有人們常用的的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)說(shuō)，血清的存在已不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，甚還有助于提高轉(zhuǎn)染效率。在轉(zhuǎn)染過(guò)程中*可以使用血清，針對(duì)RNA 轉(zhuǎn)染，消除血清中潛在的核糖核酸酶污染要格外關(guān)注。且血清比較珍貴，胎牛血清，馬或牛血清都常被用到，價(jià)格也不盡相同，根據(jù)自身選擇。

（3）細(xì)胞密度

細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有一定影響，一般轉(zhuǎn)染時(shí)貼壁細(xì)胞密度為50-90%，具體要根據(jù)選用的轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)。不同的轉(zhuǎn)染試劑適的細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會(huì)因不同的細(xì)胞類(lèi)型或應(yīng)用而異。

例如陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而要更高的細(xì)胞鋪板密度或更多的懸浮細(xì)胞數(shù)， 盡量在細(xì)胞適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，以求好的轉(zhuǎn)染效果。

（4）DNA 質(zhì)量

針對(duì)一般常用的轉(zhuǎn)染技術(shù)都是基于電荷吸引的原理轉(zhuǎn)染的，如果DNA的純度不高，存在其他雜質(zhì)，如鹽離子等都會(huì)影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成。針對(duì)市面上現(xiàn)有的超純質(zhì)粒抽提的試劑盒，能達(dá)到非常高的純度效果，從而可以避免DNA純度的影響。